Osnove qPCR
Zakaj qPCR?
Kako deluje qPCR?
Dobre in slabe strani qPCR
Kje se uporablja qPCR?
Kako se učiti o qPCR?
Zakaj qPCR? [nazaj na vrh]
PCR v realnem času oz. kvantitativni PCR (qPCR) je metoda, ki jo na mnogih področjih molekularne biologije uporabljamo za detekcijo in kvantifikacijo nukleinskih kislin (DNA, RNA). Metoda je, za razliko od klasične metode PCR, kvantitativna, kar pomeni, da omogoča natančno določanje koncentracije DNA (relativne ali absolutne) v vzorcu.
V primeru študija izražanja genov ali detekcije RNA virusov, kot tarčo pomnoževanja uporabimo RNA. V tem primeru je pred pomnoževanjem s PCR v realnem času, potrebna reverzna transkripcija (obratno prepisovanje) RNA v DNA (t.i. komplementarno DNA ali cDNA). Izraz za to kombinirano metodo je: reverzna transkripcija in verižna reakcija s polimerazo v realnem času, krajše RT-qPCR (občasno qRT-PCR).
Kako deluje qPCR [nazaj na vrh]
PCR je metoda, pri kateri encim (termo stabilna DNA polimeraza) v ciklih pomnožuje kratek specifično določen del matrične DNA (t.i. amplikon). V vsakem ciklu se število kratkih specifičnih delov DNA podvoji. Več o tem kako deluje klasična motoda PCR lahko najdete tukaj.
Postopek pri qPCR je enak, le z dvema večjima razlikama: pomnožena DNA se fluorescenčno označi (ponavadi z fluorescenčnimi barvili, ki temeljijo na cianinu), druga razlika pa je v tem, da je količina fluorescence direktno sorazmerna količini pomnožene DNA, kar spremljamo tekom celotnega procesa PCR (30 do 45 ciklov). Večje kot je začetno število DNA molekul v vzorcu, hitreje se bo povečala fluorescenca tekom PCR ciklov (glej slike 1 in 2). To je osnovni princip kvantitativnega pristopa, ki ga omogoča PCR v realnem času.
Slika 1 prikazuje grafično predstavitev pomnoževanja qPCR (prva dva cikla). Obstajajo različne različice qPCR (t.i. kemije) pri katerih se uporabljajo različni načini fluorescenčnega označevanja. Slika prikazuje dva najpogosteje uporabljana načina. Na levi je prikazan način s hidrolizno sondo, ki temelji na mehanizmu FRET (fluorescence resonance energy transfer) ter 5'eksonukleazni aktivnosti polimeraze. Pri intaktni sondi, ko sta dušilec in poročevalec dovolj skupaj se fluorescenca iz poročevalca (reporter, R) prenaša na dušilec (quencher, Q) zato je ne moremo zaznati. Med podaljševanjem verige Taq DNA polimeraza s svojo 5'-eksonukleazno aktivnostjo razgradi vezano sondo, pri čemer se molekuli poročevalca in dušilca razideta, zato lahko emitirano fluorescenco poročevalca nemoteno detektiramo. Na desni je prikazan način qPCR, pri katerem se uporabljajo fluorofori, ki začnejo močneje fluorescirati, ko se vstavijo v dvojno verižno DNA (interkalirajoča barvila npr. Sybr Green).
Slika 2 prikazuje krivulje pomnoževanja petih vzorcev (S1 do S5). Fluorescenca se povečuje z naraščajočim številom pomnožene tarčne DNA v vzorcih. Vzorec S1 je vseboval največje začetno število tarčnih DNA molekul, kar pojasnjuje najhitrejši porast fluorescence. Vzorec S4 je vseboval najnižje začetno število tarčnih DNA molekul, vzorec S5 pa ni vseboval tarčne DNA.
Obstaja več načinov fluorescenčnega označevanja pomnožene DNA (»qPCR kemije«), vendar imajo vse nekaj skupnega: omogočajo povečevanje fluorescenčnega signala tekom PCR reakcije, ki je direktno sorazmerno količini DNA.
Dobre in slabe strani qPCR [nazaj na vrh]
Prednosti qPCR pred klasično motodo PCR:
• Hitrost: pomnoženo DNA zaznamo že tekom PCR reakcije zato ni potrebe po dodatni detekciji na koncu reakcije, kot je npr. agarozna gelska elektroforeza z interkalirajočimi fluorescenčnimi barvili
• Zmogljivost: qPCR je visoko zmogljiva metoda (omogoča procesiranje velikega števila vzorcev v kratkem času). Njeno zmogljivost lahko z avtomatizacijo priprave vzorcev (DNA/RNA izolacija in nanos na qPCR plošče) še povečamo.
• Občutljivost: qPCR lahko loči tudi dvo-kratne razlike v količini tarčne DNA molekule (študij izražanja genov) in omogoča zaznavanje le nekaj kopij DNA (tudi samo eno).
• Manjše količine začetnega materiala: 1/1000 količine, ki je potrebna za klasično PCR
• Širok dinamični razpon kvantifikacije: kvantificiramo lahko zelo različne količine začetne DNA , ki se razlikujejo za 7 redov velikosti (do 107-kratni dinamični rang kvantifikacije)
• Ponovljivost: visoka.
Disadvantages of qPCR:
• Cena opreme: zaradi optičnih komponent, ki so potrebne za natančno zaznavanje fluorescence, je oprema za qPCR 5 do 10-krat dražja od aparature za klasičnoPCR.
• Cena kemikalij in potrošnega materiala: qPCR je zelo občutljiva metoda, zato je zelo pomembna natančna sestava in visoka kakovost reakcijskih mešanic. Iz tega razloga kupujemo reakcijske mešanice, ki so že pripravljene za uporabo (master mix). Zaradi detekcije fluorescence potrebujemo posebno plastikovino.
• Inhibicija PCR: zaradi kompleksne narave bioloških vzorcev, nepopolnega očiščenja DNA/RNA tekom izolacije nukleinskih kislin itd. lahko pride do inhibicije PCR reakcije z določenimi inhibitorji (DNA polimeraza je encim, občutljiv na delovanje določenih substanc, ki inhibirajo njegovo aktivnost – polimerizacijo DNA), kar lahko oteži kvantifikacijo.
• Občutljivost na napake: qPCR je izjemno občutljiva metoda ter je posledično zelo občutljiva na napake. To pomeni, da lahko celo najmanjše napake bistveno vplivajo na končni rezultat. Najbolj variabilna in kritična točka je priprava vzorcev (DNA izolacija in reverzna transkripcija). Zato je potrebno vedno vključiti kontrolne reakcije zraven vzorcev, ko opravljamo qPCR.
• Analiza podatkov: analiza podatkov in interpretacija rezultatov sta bolj zapleteni.
Kje se uporablja qPCR? [nazaj na vrh]
Zaradi nekaterih zelo pomembnih prednosti je področje uporabe qPCR zelo široko. Metoda se uporablja dovolj dolgo, da so raziskovalci lahko dokazali njeno zanesljivost in robustnost, proizvajalci pa so razvili zanesljivo qPCR opremo. Najpogosteje se qPCR uporablja v molekularni diagnostiki, kjer počasi zamenjuje konvencionalne metode. Uporablja se za detekcijo, identifikacijo in kvantifikacijo mikroorganizmov, ki povzročajo bolezni (bakterije, virusi in glive; slika 3). S qPCR je skrajšano laboratorijsko delo, s tem pa tudi možnosti kontaminacij in napačnih rezultatov. qPCR je zelo zmogljiva metoda, kar pomeni, da lahko večje količine podatkov obdelamo v krajšem času. qPCR je zato dokazano odlična metoda za diagnostične laboratorije. Treba pa je poudariti, da metoda detektira samo prisotnost DNA ali RNA mikroorganizmov, kar ni dokaz za njihovo živost. Zato občasno poleg qPCR uporabimo še klasične mikrobiološke tehnike.
Slika 3 prikazuje virus pahljačavosti listov niske trte (Grapevine fanleaf virus, GFLV) posnet s transmisijskim elektronskim mikroskopom, eno izmed konvencionalnih in zahtevnih tehnik, ki jih je zamenjala uporaba RT-qPCR (fotografija: NIB).
qPCR se uporablja tudi za detekcijo in kvantifikacijo gensko spremenjenih organizmov, ali za genotipizacijo. Postopek genotipizacije omogoča detekcijo različnih alelov istega gena ali SNPs (single nucleotide polymorphisms), ki jih lahko uporabljamo kot genetske diagnostične markerje ali prognostične markerje za določene bolezni.
Zelo pomembno področje uporabe so študije izražanja genov, ki nam pomagajo razumeti biološke procese na različnih področjih znanosti: biologija, mikrobiologija, medicina in ostale. Zelo koristna, in skoraj nujna kombinacija je preučevanje celotnega genoma z DNA mikromrežami, ki ji sledi validacija rezultatov s qPCR. DNA mikromreže so izredno zmogljiva metoda, vendar manj občutljiva in natančna, zato zahteva validacijo rezultatov. qPCR je zato zelo pomembna raziskovalna metoda.
Kako se naučiti metode qPCR [nazaj na vrh]
Najboljši način učenja teoretičnih in praktičnih osnov ter večjih in manjših trikov je učenje od raziskovalcev, ki se s to metodo ukvarjajo že več let.
Udeležite se ene izmed qPCR Experience delavnic.